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【医学新观点】CXCL12基因G801A多态性与子痫前期发病的相关性

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周三妇产科


作者:陈凯

单位:青岛大学医学院生物教研室

子痫前期是临床上导致孕妇死亡及胎儿死亡的重要产科疾病,发生率约占妊娠妇女的5%。子痫前期发病机制的研究一直是产科领域的热点,但其发病机制至今不清。目前认为,子痫前期的发病机制主要与胎盘浅着床、血管内皮受损、免疫反应、遗传因素、炎症反应等有关。研究表明,遗传因素在子痫前期的发病中起了重要作用,且越来越多的学者认为异常胎盘形成可能是子痫前期的诱发因素。胎盘发育不完善主要是因为滋养细胞侵蚀不良,此时,螺旋小动脉重铸异常引起管腔狭窄,以至于胎盘血流减少,胎盘缺血、缺氧。研究表明,CXCL12基因表达异常会干扰滋养细胞正常分化以及引起生理功能紊乱,这可能是子痫前期发生的诱因。CXCL12基因多态性被认为是影响CXCL12基因表达的重要遗传因素,目前未见关于CXCL12基因多态性与子痫前期相关性研究的报道。本研究主要探讨CXCL12基因G801A多态性与子痫前期发病的相关性,从分子遗传学角度探讨子痫前期的发病机制。

资料与方法


1.资料来源:

研究对象分别来自2012年1月–2014年6月在青岛大学附属医院、山东省临沂市人民医院、山东省枣庄市妇幼保健院、山东省聊城市人民医院、滨州医学院附属医院、烟台毓璜顶医院、烟台山医院、山东省菏泽市第二人民医院、山东省聊城市东昌府区妇幼保健院等9家医院住院的子痫前期孕妇共912例(子痫前期组),并根据临床分类标准将子痫前期孕妇分为轻度子痫前期和重度子痫前期;此外,又根据发病时间将子痫前期孕妇分为早期子痫前期(<34孕周)和晚期子痫前期(≥34孕周),子痫前期的诊断标准参照《妇产科学》(第6版)。对照组为同期足月分娩的健康孕妇,共1 025例,年龄26岁以上。子痫前期组和对照组孕妇均为中国汉族妇女,两组年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05);均无慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病或肝病病史,无输血及免疫治疗史,且不包括胎膜早破、前置胎盘、先兆流产、先兆早产、人工授精、双胎及巨大儿孕妇。两组孕妇入院孕周、分娩孕周及血压比较,差异有统计学意义(P<0.05)。本研究经青岛大学伦理委员会批准,所有对象均签署知情同意书。

2.方法:

(1)基因组DNA的提取:抽取所有孕妇的肘静脉外周血2 ml,抗凝,置于-20 ℃冰箱备用。采用标准方法提取外周血基因组DNA,置于-20 ℃冰箱备用。(2)特异性CXCL12基因G801A多态性的PCR扩增:应用Primer Premier 5.0软件进行引物设计,由英国英维捷基公司合成;上游引物5'-CAGTCAACCTGGGCAAAGCC-3',下游引物5'-AGCTTTGGTCCTGAGAGTCC-3'。PCR的总反应体系为10 μl,包括3.5 μl超净水、5 μl混合液(由DNA聚合酶、PCR缓冲液和三磷酸脱氧核苷组成)、0.25 μl上游引物、0.25 μl下游引物、1.0 μl DNA模板;反应条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s, 63 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s,循环35次,72 ℃延伸7 min,最后置于4 ℃终止反应。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳,检测PCR扩增产物是否为目的条带。预期的CXCL12-G801A的PCR扩增产物为302 bp。(3)酶切基因分型:应用限制性内切酶Msp Ⅰ对PCR扩增产物在37℃恒温箱中酶切24 h,酶切总体系10 μl(含3 μl PCR扩增产物、0.5 μl限制性内切酶、1 μl缓冲液、5.5 μl双蒸水)。酶切产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳并行核酸染料染色,经凝胶成像系统成像后读取基因型。PCR扩增产物经酶切后电泳获得3种基因型:AA基因型,1条条带(即302 bp片段);GG基因型,2条条带(即202、100 bp片段);AG基因型,3条条带(即302、202和100 bp 3个片段)。

3.统计学方法:

所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计学处理。连续性变量以±s表示,分类变量用百分率表示。组间单因素比较采用t检验或非参数检验。基因型分布采用Hardy-Weinberg平衡检验,以明确是否具有群体代表性。两组间基因型频率及等位基因频率的比较采用χ2检验。





结果


1.Hardy-Weinberg平衡检验结果:

子痫前期组及对照组孕妇CXCL12基因G801A位点分布均符Hardy- Weinberg遗传平衡定律(P>0.05),证明其均具有群体代表性。

2.两组孕妇CXCL12-G801A基因型及等位基因频率的比较:

G801A位点的基因多态性在两组孕妇中的各基因型频率分布无差异(χ2=2.10,P>0.05)。子痫前期组孕妇中A、G等位基因频率与对照组孕妇中A、G等位基因频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.71,P>0.05)。见表1。其中,又把子痫前期孕妇分为轻度子痫前期和重度子痫前期组,分析两组的基因型和等位基因频率分布,结果均无差异(基因型:χ2=0.63,P>0.05;等位基因:χ2=0.17,P>0.05)。

表1

两组孕妇CXCL12基因G801A基因型及等位基因频率的比较

3.早期和晚期子痫前期组孕妇CXCL12-G801A基因型及等位基因频率的比较:

早期子痫前期组孕妇中各基因型频率的分布[AA 33例(11.7%,33/283),AG 118例(41.7%,118/283),GG 132例(46.6%,132/283)]与晚期子痫前期组孕妇中各基因型频率的分布[AA 68例(10.8%,68/629),AG 244例(38.8%,244/629),GG 317例(50.4%,317/629)]相比,两组间无差异(χ2=1.10,P>0.05)。早期子痫前期组孕妇中A、G等位基因频率分别为32.5%(184/566)、67.5%(382/566);晚期子痫前期组孕妇中A、G等位基因频率分别为30.2%(380/1 258)、69.8%(878/1 258);两组比较,差异无统计学意义(χ2=0.97,P>0.05)。




讨论



趋化因子CXCL12,又称基质细胞源性因子1 (stromal cell-derived factor-1,SDF-1),属于趋化因子CXC亚家族,最初由骨髓来源的基质细胞系克隆得到,随后被鉴定为前B细胞生长刺激因子。CXCL12的受体有两种,分别为CXCR4和CXCR7,都属于G蛋白偶联受体。CXCL12在多种细胞和组织中表达,如脑、心脏、肾、肝、肺和骨髓等。CXCL12能诱发造血干细胞动员和归巢,同时在组织血管发生、炎症反应、免疫细胞的发育及免疫系统的自身稳定、肿瘤细胞侵袭转移和胚胎生长发育中均起着重要作用。研究表明,CXCL12及其受体CXCR4和CXCR7均在胎盘组织中广泛表达,CXCL12/CXCR4/CXCR7轴能促进滋养细胞的分化、增殖和侵袭。研究表明,CXCL12表达异常会引起滋养细胞正常分化受到干扰以及生理功能紊乱,这可能会成为子痫前期发生的诱因。CXCL12基因定位于10q11.1,有6个外显子。CXCL12-G801A多态性是位于801位点的单核苷酸多态性,靠近3'非翻译区的起始密码子,涉及G>A转换。A等位基因可能作为顺式作用因子上调CXCL12的表达。此位点的多态性是CXCL12基因研究最多的多态性位点。

近年来的研究表明,CXCL12基因可能与子痫前期的发生、发展相关。Li等研究发现,滋养细胞来源的CXCL12可促进蜕膜间质细胞表达CD82,而CD82可以抑制滋养细胞内ERK1/2信号通路,促进滋养细胞金属蛋白酶组织抑制剂1的表达进而削弱滋养细胞的侵袭能力。这可能会造成滋养细胞侵袭子宫组织过浅而诱发子痫前期。Ji等通过对小鼠的研究发现,CXCL12表达异常会引起滋养细胞正常分化受到干扰以及生理功能紊乱,可能会导致子痫前期的发生。Zhao等证实,CXCL12/CXCR4轴可以活化表皮生长因子受体进一步激化ERK信号通路;同时,Wang等证实,活化的ERK信号可以激活下游的转录因子––核因子κB (NF-κB),Vásárhelyi等发现,子痫前期患者胎盘的NF-κB及p50转录因子结合位点增多,NF-κB可增加炎症细胞因子的产生,由此可以推测,CXCL12可能与子痫前期炎症反应的发生有关。此外,有研究发现,子痫前期患者滋养层和母血血清中的CXCL12水平增加。Wen等研究发现,损伤组织的CXCL12表达水平会明显增加,并可诱导表达其配体CXCR4的干细胞到损伤组织,参与损伤的修复。因此,也有学者认为,CXCL12基因参与了子痫前期的补偿机制。

本研究结果显示,与对照组相比,子痫前期组孕妇CXCL12-801位点AA、AG、GG这3种基因型频率的分布无显著差异。等位基因A、G频率在对照组和子痫前期组之间的分布也无显著差异。本研究又根据临床分类标准把子痫前期分别分为轻度子痫前期和重度子痫前期,分析统计两者的基因型和等位基因频率分布,结果均无显著差异。此外,本研究又根据发病时间把子痫前期分为早期子痫前期和晚期子痫前期,分析统计两者的基因型和等位基因频率分布,结果也均无显著差异。提示该位点多态性与中国汉族人群子痫前期发病无明显相关性。

子痫前期发病机制极其复杂,基因与环境存在共同作用,同时,CXCL12基因存在不同的多态性位点,各多态性位点间可能存在相互影响。虽然本研究证实了CXCL12基因G801A位点单核苷酸多态性与子痫前期的发病无关,但基因多态性受种族、人群、地域等多种因素的影响,并且,CXCL12基因可能在转录、翻译等不同水平影响子痫前期的发病。因此,确定子痫前期的发病与CXCL12基因多态性的相关性仍需要大样本量、多种族、多位点的重复实验进一步验证。






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